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石云教授课题组发现谷氨酸受体神经细胞内转运

2019-12-04 11:47

2018年11月19日,南京大学模式动物研究所、南京大学生物医药国家重点实验室和鼓楼医院联合中心、南京大学脑研究院石云课题组在国际著名杂志《Nature Communications》上在线发表题为“Signal peptide represses GluK1 surface and synaptic trafficking through binding to amino-terminal domain”的研究成果,揭示信号肽对于大脑神经细胞之间信号传递功能的调控作用。南京大学博士生段桂芳是该工作的第一作者,南京大学的石云教授和中国科学院昆明动物研究所的盛能印研究员为本文的共同通讯作者,共同作者里还有中国科学技术大学的金腾川博士和UCSF的Roger Nicoll教授等。

人的大脑中约含有100亿个神经元,它们通过神经突触这一个独特而又基本的结构实现信息传递交流和整合。突触前神经元释放的神经递质,进入突触间隙之后会与定位于突触后膜的神经递质受体相结合,引起突触后神经元活性变化,从而实现神经信息的跨细胞传递。这一过程的调控异常被认为是神经精神疾病发生的重要原因之一,也是相关疾病干预治疗的重要靶点。

人的大脑是由约100亿个神经元组成,这些神经元通过突触这种特化细胞间连接结构进行信息交换。突触前神经元通过突触前膜释放神经递质,结合于突触后膜的神经递质受体,引起突触后神经元的电生理变化,从而实现神经信号的跨细胞传递。在大脑内,兴奋性的信号传递主要是由突触前膜释放的谷氨酸结合于突触后膜的谷氨酸受体来实现的。因此,谷氨酸受体在神经细胞内合成,转运并恰当地定位到突触后膜对于大脑正常行驶功能具有重要的意义。

在大脑内,谷氨酸是主要的兴奋性神经递质传递,与其对应的谷氨酸受体在神经元突触部位的表达水平,则是突触信息传递的效率和神经网络活性重要决定因素之一。谷氨酸受体在神经元中需要转运至细胞膜,以及定位到突触后膜,这对于大脑行使正常生理功能过程至关重要。

通过与盛能印博士的合作,石云课题组在利用CA1椎体神经元来研究Kainate-型谷氨酸受体的突触功能时发现:在CA1神经元表达GluK2受体能够进入突触后膜,极大地增强突触后电流,而表达GluK1受体却不能进入突触后膜,不影响EPSCs(Sheng et al., 2015; Sheng et al., 2017)。为了解析KAR受体的突触定位机制,石云课题组依据GluK1和GluK2蛋白结构的相似性,构建和检测了一系列的嵌合型突变受体。他们意外发现GluK1的前导信号肽发挥着关键性调节作用。当GluK1的信号肽替换为GluK2信号肽时,GluK1受体成功定位到突触上,并且该GluK1受体能够10倍地增强突触后电流,其幅度与GluK2类似 。课题组人员推测,这个现象存在两种可能的机理,第一、GluK2的“超级”信号肽赋予了GluK1额外的突触转运能力。第二、GluK1信号肽抑制了其本身具有的突触后膜转运能力。为了区分这两种可能性,课题组人员设计了两个实验。第一个实验是将GluK1的信号肽换成GluA1的“弱”信号肽,因为过去的研究表明在CA1神经元表达GluA1时,并不能增强突触活性,结果在这个“弱”信号肽带领下,GluK1同样可以增强突触电流 (Fig. 1B, E)。第二个实验更直接,将GluK1的信号肽和GluK1共同表达在同一个神经元中,结果GluK1的突触增强效应被完全抑制 (Fig. 1C,D,F),说明GluK1的信号肽对于GluK1的突触定位具有反式抑制作用。进一步的解析发现GluK1的信号肽和氨基端结构域共同发挥抑制作用,缺一不可。生物化学实验进一步证明GluK1的信号肽可以和GluK1的ATD相互结合。同时,课题组研究人员也发现,信号肽不仅抑制GluK1的突触定位,也抑制了上膜转运。所有这些研究结果表明,GluK1受体的信号肽能够作为一个非常规配体,结合于其ATD结构域,行驶调节GluK1受体胞内转运和突触定位的功能 。

KAR型谷氨酸受体在中枢神经系统中发挥重要调节功能,与多种神经精神疾病的发生发展密切相关。中国科学院昆明动物研究所研究员盛能印长期从事KAR受体相关研究,并在前期工作中取得一系列研究成果(Elife 2015;JBC 2017;PNAS 2017)。发现其关键性亚基成员GluK1和GluK2虽然同源性很好,但在神经元中的转运活性是完全不同的,GluK1缺乏自主转运能力,而GluK2具有自主转运能力。此外,这两种受体转运能力的差异是由它们自身细胞外氨基端功能结构域所决定的。

传统的观点认为前导信号肽只是编码新合成蛋白的胞内定位信号,它将新合成的肽链导入内质网,从而最终进入分泌途径或者定位到细胞膜。一般来说,信号肽把肽链导入内质网就完成了其功能,在内质网膜上被信号肽酶切割下来,和后续的转运没有关系。本论文发现了GluK1的信号肽除了指导GluK1进入内质网的经典功能之外,还有调节后续转运的全新功能,这也是膜蛋白的信号肽研究方面的新发现。值得一提的是,本研究是在石云教授参与的一系列研究工作的基础上做出的(Granger et al., 2013; Sheng et al., 2018; Sheng et al., 2015; Sheng et al., 2017)。石云教授的这个成果也和他的团队在2016年的发现(He et al., 2016)遥相呼应。在2016年的论文中,课题组研究人员发现AMPA型谷氨酸受体GluA1/A2的空间排列是由GluA1的信号肽决定的。因此,石云教授的研究表明谷氨酸受体的信号肽在受体的合成和转运中的作用远超其传统功能,而谷氨酸受体的合成和转运也远比预想的要复杂。这些工作揭开了谷氨酸受体胞内复杂合成、装配和转运机制的冰山一角。

昆明动物所盛能印课题组与南京大学模式动物研究所石云课题组就这一科学问题展开深入合作,揭示了信号肽调控谷氨酸受体在神经细胞中转运活性的非经典功能,研究成果以Signal peptide represses GluK1 surface and synaptic trafficking through binding to amino-terminal domain 为题,于11月19日在线发表在《自然-通讯》(Nature Communications)上。

图片 1

为了解析KAR受体的转运调控机制,依据GluK1和GluK2蛋白结构的相似性,研究人员构建一系列嵌合型突变受体,利用电生理膜片钳技术,在海马培养脑片的兴奋性CA1神经元中分析这些KAR突变受体的突触传递活性。在研究过程中,他们意外发现GluK1的信号肽发挥着关键性调控作用。当将GluK1受体的信号肽替换为GluK2信号肽时,GluK1受体则成功定位于突触后膜,并且该GluK1突变受体能够成倍地增强突触后电流大小,其幅度与野生型GluK2类似。研究人员推测,该现象存在两种可能性:第一,GluK2的“超级”信号肽赋予了GluK1额外的突触转运能力;第二,GluK1信号抑制了其本身所具备的突触后膜转运能力。为了区分这两种可能性,他们首先利用GluA1受体的“弱”信号肽,因为有研究表明在神经元中表达GluA1并不能增强突触活性,结果发现所构建的GluK1受体同样可以增强突触电流大小。更为直接的实验证据是,当将GluK1的信号肽和GluK1共同表达在同一个神经元中时,GluK1受体的增强突触活性的能力则被完全抑制,表明GluK1的信号肽对于GluK1的突触定位具有反式抑制作用。

图一

有研究表明,在某些GPCR受体中,信号肽不被切割以发挥调控作用。因此,研究人员通过构建不同的带有分子标签的受体突变体,通过生物化学分析,发现在成熟的GluK1和GluK2受体中,其信号肽均被有效切割。进一步的解析发现,GluK1的信号肽和氨基端结构域有着协同效应以发挥抑制作用,缺一不可。若将GluK1的ATD替换为GluK2的对应序列,同样可以解除GluK1信号肽的抑制转运功能。生物化学实验进一步证明GluK1的信号肽是通过与GluK1的ATD直接相互作用,以形成抑制性复合物,该作用机制也在GluK1细胞膜转运过程中发挥作用。因此,该研究发现,GluK1受体的信号肽能够作为非常规配体,与其ATD结构域相互作用,从而调节GluK1受体胞内转运和突触定位过程。

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